En Nueva York, desempleados y divorciado Larry Daley es un perdedor. Su hijo Nick está muy decepcionado con su padre, quien va a ser desalojado. Larry acepta el trabajo de vigilante nocturno en el Museo de Historia Natural y toma el lugar de tres guardias de seguridad antiguos que sólo se han retirado con el fin de recaudar dinero y pagar sus deudas. En su primer turno, Larry pronto se da cuenta que todo en el Museo no es como parece como las estatuas empiezan a venir a la vida después de la puesta del sol. El Museo se transforma en un caos total con el inexperto Larry a cargo como se entera de que una vieja piedra egipcio que llegó al Museo en 1950 trae estas estatuas a la vida hasta el amanecer. Cuando Larry trae a su hijo a pasar una noche con él, los tres guardias viejas entrar en el Museo para tratar de robar la piedra mágica. Larry organiza todos los personajes históricos para ayudarle a detener a los criminales y salvar el Museo.